Репликация ДНК. Ферменты репликации

На основе родительской молекулы ДНК. Репликацию ДНК осуществляет сложный комплекс, состоящий из 15-20 различных белков-ферментов, называемый реплисомой (англ. ) С помощью специальных ферментов двойная спираль материнской ДНК расплетается на две нити, на каждой образовавшейся нити достраивается вторая нить, образуя две идентичных дочерних молекулы ДНК, которые затем скручиваются в отдельные спирали. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение.

История изучения

Каждая молекула ДНК состоит из одной цепи исходной родительской молекулы и одной вновь синтезированной цепи. Такой механизм репликации называется полуконсервативным. В настоящее время этот механизм считается доказанным благодаря опытам Мэтью Мезельсона и Франклина Сталя ( г.) . Ранее существовали и две другие модели: «консервативная» - в результате репликации образуется одна молекула ДНК, состоящая только из родительских цепей, и одна, состоящая только из дочерних цепей; «дисперсионная» - все получившиеся в результате репликации молекулы ДНК состоят из цепей, одни участки которых вновь синтезированы, а другие взяты из родительской молекулы ДНК. Молекула ДНК разрезается пополам и образутся два шаблона. Два шаблона выходят из репликационной вилки. Если представить их в выпрямленном виде, то можно видеть линейку из гребёнок, которые соединены концами, но имеют промежуток. Представим что одна гребёнка синяя, а другая - красная. Теперь подставим нижнюю красную (она из пяти гребней, как и верхняя) пятым концом к третьему верхнему (третьей верхней иголке). Удлиним цепь и сверху и снизу. Как бы получится: пять, три, пять и т. д.- наверху и снизу тоже. Потом к этим гребёнкам добавляются после выхода шаблонов (гребёнок) из репликационной вилки ещё два шаблона. Из одной молекулы ДНК получается две идентичные материнской (если нет мутаций) молекулы, это называется полуконсервативностью.

Общие представления

Репликация ДНК - ключевое событие в ходе деления клетки . Принципиально, чтобы к моменту деления ДНК была реплицирована полностью и при этом только один раз. Это обеспечивается определёнными механизмами регуляции репликации ДНК. Репликация проходит в три этапа:

1. инициация репликации
2. элонгация
3. терминация репликации.

Регуляция репликации осуществляется в основном на этапе инициации. Это достаточно легко осуществимо, потому что репликация может начинаться не с любого участка ДНК, а со строго определённого, называемого сайтом инициации репликации . В геноме таких сайтов может быть как всего один, так и много. С понятием сайта инициации репликации тесно связано понятие репликон . Репликон - это участок ДНК, который содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта. Геномы бактерий , как правило, представляют собой один репликон, это значит, что репликация всего генома является следствием всего одного акта инициации репликации. Геномы эукариот (а также их отдельные хромосомы) состоят из большого числа самостоятельных репликонов, это значительно сокращает суммарное время репликации отдельной хромосомы. Молекулярные механизмы, которые контролируют количество актов инициации репликации в каждом сайте за один цикл деления клетки, называются контролем копийности. В бактериальных клетках помимо хромосомной ДНК часто содержатся плазмиды , которые представляют собой отдельные репликоны. У плазмид существуют свои механизмы контроля копийности: они могут обеспечивать синтез как всего одной копии плазмиды за клеточный цикл , так и тысяч копий .

Репликация начинается в сайте инициации репликации с расплетания двойной спирали ДНК, при этом формируется репликационная вилка - место непосредственной репликации ДНК. В каждом сайте может формироваться одна или две репликационные вилки в зависимости от того, является ли репликация одно- или двунаправленной. Более распространена двунаправленная репликация. Через некоторое время после начала репликации в электронный микроскоп можно наблюдать репликационный глазок - участок хромосомы, где ДНК уже реплицирована, окружённый более протяжёнными участками нереплицированной ДНК .

В репликационной вилке ДНК копирует крупный белковый комплекс (реплисома), ключевым ферментом которого является ДНК-полимераза . Репликационная вилка движется со скоростью порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту у прокариот и 500-5000 - у эукариот .

Ферменты и их функции

Фермент	Функция
ДНК-гираза	Вносит временные двуцепочечные разрывы в ДНК, облегчая её разматывание.
Хеликаза	Разделяет цепи двухцепочечной молекулы ДНК на одинарные цепи.
SSB-белки	Связывают одноцепочечные фрагменты ДНК и предотвращают комплементарное спаривание.
Праймаза	Синтезирует РНК-затравку (праймер) - короткий фрагмент РНК, которая является инициатором в работе ДНК-полимеразы (полимераза не способна синтезировать ДНК с нуля, но может добавлять нуклеотиды к уже имеющимся).
ДНК-полимераза	Синтезирует ДНК, связываясь с праймером. Следует отметить, что один конец материнской ДНК полимераза синтезировала непрерывно и в одном направлении, а второй - в противоположном - фрагментами.
Белки скользящего зажима (застежки)	Окружают кольцом ДНК и «скользят» по ней вместе с продвигающейся вперед фермента ДНК-полимеразы. Они предотвращают диссоциацию фермента от матрицы ДНК и повышают эффективность его работы.
РНКаза H	Удаляет уже ненужные фрагменты РНК-затравки.
ДНК-лигаза	Сшивает фрагменты ДНК (фрагменты Оказаки).
Теломераза	Добавляет особые повторяющиеся последовательности нуклеотидов к одному концу цепи ДНК на участках теломер, тем самым компенсируя их укорачивание во время деления.
Реплисома (комплекс всех ферментов репликации)	Движется вдоль молекулы ДНК-матрицы, расплетая её и наращивая комплементарные цепи ДНК.

Подробное рассмотрение молекулярных механизмов регуляции репликации ДНК выходит за рамки книги, поэтому ограничимся несколькими замечаниями по данному вопросу и более детально обсудим лишь механизм регуляции репликации у E. coli, в том числе и бактериальных плазмид, что имеет непосредственное отношение к функционированию плазмидных векторов в бактериальных клетках.

Синтез ДНК тесно связан с другими процессами, подготавливающими деление клеток, так как передача необходимой генетической информации родительских клеток дочерним является для клеток-потомков жизненно важной. Наличие избыточной генетической информации отрицательно сказывается на жизнеспособности клеток, тогда как недостаток ее, возникающий вследствие недорепликации ДНК, приводит к летальному эффекту из-за отсутствия жизненно важных генов. Однако процесс передачи генетической информации от родительских клеток дочерним у эукариот не ограничивается простой редупликацией ДНК хромосом. Так, для насекомых многих видов характерно наличие гигантских политенных хромосом, которые возникают в результате множественных раундов репликации ДНК исходных хроматид, не сопровождающейся их расхождением.

Политенизация хромосом представляет обширный класс генетических явлений, связанных с избирательной избыточной репликацией (мультипликацией ) или недорепликацией отдельных генетических локусов эукариот. Ярким примером такого рода является изменение числа генов рибосомных РНК у животных. Амплификация генов рРНК в ооцитах амфибий происходит путем образования их внехромосомных (экстрахромосомных) копий в виде кольцевых молекул рибосомных (р) ДНК, которые далее реплицируются по механизму "катящегося кольца". При этом в каждой клетке амплифицируется только по одному из сотен повторов рДНК, так что амплификация рДНК на одном повторе каким-то образом подавляет процесс амплификации на других, и все образовавшиеся повторы одного ооцита идентичны, но отличаются от наборов амплифицированных рДНК других ооцитов. Строгая стадие- и тканеспецифичность, а также избирательная амплификация только одного повтора рДНК указывают на наличие тонких регуляторных механизмов процесса репликации и в этом случае.

Характерными примерами возрастания числа генов вследствие их избирательной репликации являются магнификация генов рРНК и изменение числа генов, определяющих устойчивость клеток к лекарственным препаратам. В первом случае утрата части генов рРНК у дрозофилы в результате делеции сопровождается постепенным восстановлением их числа, тогда как во втором случае у клеток, находящихся в условиях селективного действия токсичного для них лекарственного препарата, возрастает число копий генов, необходимых для его нейтрализации. В частности, это характерно для гена дигидрофолатредуктазы в присутствии метотрексата. Высказывается предположение, что в основе изменения числа копий таких генов лежит механизм неравного кроссинговера.

Репликация хромосом бактерий тесно сопряжена с метаболизмом клеток. Например, частота инициаций новых раундов репликации зависит от скорости роста бактериальных клеток, и в клетках быстро растущих бактерий могут содержаться хромосомы с несколькими работающими репликативными вилками, хотя для репликации одной бактериальной хромосомы их требуется только две, инициированные в единственной области начала репликации (ori) и расходящиеся в противоположных направлениях. Это позволяет бактериям при благоприятных условиях затратить для генерации меньше времени, чем для полной репликации бактериальной хромосомы. Очевидно, что для поддержания строго упорядоченного характера репликации должны существовать тонкие механизмы регуляции репликации на уровне инициации новых раундов. Такие механизмы, действительно, существуют.

Наиболее хорошо изученными в настоящее время являются механизмы регуляции синтеза ДНК у E. coli, в том числе механизмы контроля числа копий у небольшой плазмиды E. coli ColE1, которые будут рассмотрены ниже более подробно из-за важности этих явлений для генной инженерии.
^

4.2.1.Инициация репликации ДНК у E. coli и ее регуляция

Репликация хромосомной ДНК у бактерий играет ключевую роль в их жизненном цикле. В ходе этого процесса микроорганизмы редуплицируют свой геном, а образовавшиеся дочерние геномы далее переходят в дочерние клетки. Высокая точность, с которой бактерии осуществляют такие процессы, указывает на наличие специальных механизмов их координации и контроля.

^ Структура области начала репликации oriC. Хромосома E. coli содержит единственную область начала репликации (origin), названную oriC , на которой происходит инициация репликации (рис. I.47,а ). Размер минимальной области начала репликации, обеспечивающей автономную репликацию хромосомы, составляет 258 п.о. (положение 11–268 на рис. I.47). Сравнение первичных структур областей начала репликации различных энтеробактерий показало, что их последовательности представлены короткими консервативными участками, которые перемежаются дивергировавшими сегментами ДНК, длины которых, однако, высококонсервативны. Консервативные участки оказались сайтами связывания регуляторных белков, разделенных спейсерными последовательностями. OriC содержит пять консенсусных 9-нуклеотидных сайтов связывания инициатора DnaA (непалиндромные повторы), названных DnaA-боксами. У всех энтеробактерий области начала репликации содержат 9–14 сайтов GATC, положение восьми из которых консервативно.

В левой части oriC находится AT-богатая область, содержащая три похожих последовательности длиной в 13 нуклеотидов, каждая из которых начинается с GATC. Здесь же локализован AT-кластер, который вместе с левой 13-нуклеотидной последовательностью образует область нестабильной спирали ДНК (ДНК-расплетающий элемент ). Этот участок ДНК может быть заменен без потери функции на аналогичный по нуклеотидному составу, но с другой последовательностью нуклеотидов.

OriC содержит сайты связывания белков, изгибающих ДНК, IHF (integration host factor) и FIS (factor for inversion stimulation). Оба белка, по-видимому, помогают инициатору DnaA раскручивать ДНК.

Димерный белок IciA, состоящий из субъединиц с молекулярной массой 33 кДа, специфически связывается с AT-богатыми 13-мерными повторами. Функция этого белка неизвестна, так же как и функция белка Rob, который специфически взаимодействует с 26-нуклеотидным сайтом в правой части DnaA-бокса R4. ДНК вблизи Rob-сайта обнаруживает изгиб, который более ярко выражен у молекул, полностью метилированных Dam-метилтрансферазой (см. ниже). С такими полностью метилированными ДНК взаимодействует гистоноподобный белок H-NS, сайт связывания которого перекрывается с Rob-сайтом. Это взаимодействие оказывает влияние на функционирование oriC .

Рис. I.47. Структура области начала репликации хромосомы E. coli (а ) и схема инициации ее репликации (б )

HobH – белок, взаимодействующий с метилированной по одной цепи ДНК области начала репликации (hemimethylated origin binding)
^ Функции белка DnaA. Белок DnaA играет ключевую роль в сборке реплисомы – многокомпонентного белкового комплекса, осуществляющего двунаправленный синтез ДНК. Белок распознает область начала репликации и привлекает к месту сборки остальные белковые компоненты реплисомы.

^ Этапы инициации синтеза ДНК на oriC . Сборка исходного комплекса начинается с взаимодействия белка DnaA с DnaA-боксами R1–R4 и M (см. рис. I.47,б ). Для успешного прохождения последующих этапов сборки реплисомы белок DnaA должен находиться в комплексе с ATP и взаимодействовать с сверхспирализованным oriC . С помощью электронного микроскопа исходный комплекс обнаруживается в виде компактной эллипсоидной структуры, содержащей 20 мономеров DnaA, которая закрывает oriC . Исходный комплекс обладает высокоупорядоченной структурой.

В присутствии ATP в высокой концентрации (5 мМ) исходный комплекс превращается в открытый комплекс . В этом комплексе происходит частичное расплетение АТ-богатых 13-нуклеотидных повторов, расположенных в левой части oriC . При 37 ° или выше единственный белок DnaA может обеспечивать расплетение ДНК. Для образования открытого комплекса при более низких температурах требуется участие структурирующего белка HU или интеграционного фактора бактерии-хозяина IHF. В открытом комплексе обнаруживают небольшие участки расплетенной ДНК в правой части oriC между DnaA-боксами R2 и R4, которые рассматривают как места посадки хеликазы.

Белок DnaB является хеликазой репликативной вилки и входит в открытый комплекс с образованием препраймирующего комплекса I , взаимодействуя с одноцепочечными участками частично расплетенной ДНК. Такие участки подготавливаются белком DnaA, который вытесняет SSB-белок с соответствующих сайтов. DnaB входит в препраймирующий комплекс I в виде гексамеров, образовавших комплекс с шестью мономерами DnaC, каждый из которых связывает одну молекулу ATP. В этом комплексе хеликазная активность белка DnaB блокирована. Освобождение DnaC из комплекса происходит в результате гидролиза ATP. Следствием этого является активация хеликазы DnaB и ее правильное расположение в комплексе. Совокупность этих событий превращает препраймирующий комплекс I в препраймирующий комплекс II .

Хеликаза должна начать функционировать в месте старта репликативной вилки в правой части oriC вблизи DnaA-боксов R2, R3 и R4. Для этого она должна быть транслоцирована от места ее первоначального вхождения в комплекс к точке начала репликации. Предполагается, что транслокация ассоциирована с ATP-зависимым освобождением из комплекса белка DnaC, что сопровождается активацией хеликазы.

В праймирующем комплексе хеликаза DnaB взаимодействует с DnaG-праймазой, которая играет ключевую роль в обеспечении инициации репликации именно на oriC . Оба этих фермента обеспечивают сопряжение функционирования двух репликативных вилок, движущихся в противоположные стороны. В бесклеточной системе при низких концентрациях праймазы репликация становится однонаправленной и может инициироваться не на oriC . В праймирующем комплексе присутствие белка DnaA больше не требуется, и он после освобождения из комплекса может быть повторно использован для инициации репликации на другом oriC . Полагают, что во время координированной сборки двух репликативных вилок в одной из них синтезируется праймер, который становится затравкой при синтезе ведущей цепи другой репликативной вилкой, движущейся в противоположном направлении. Праймаза в праймирующем комплексе функционирует по дистрибутивному механизму. После синтеза праймеров она покидает репликативную вилку и заменяется новой молекулой праймазы во время образования очередного фрагмента Оказаки.

При образовании реплисомы в каждой репликативной вилке происходит ATP-зависимое формирование димерного комплекса холофермента ДНК-полимеразы III, связанного с 3"-концами праймеров (скользящий зажим, см. выше). Вслед за этим происходит координированная элонгация праймеров, сопровождаемая двунаправленным синтезом ведущих и отстающих цепей ДНК. В бесклеточной системе точки начала синтеза ведущих цепей локализованы в oriC вблизи DnaA-боксов R2, R3 и R4.

^ Механизмы контроля инициации репликации in vivo. Инициация репликации ДНК у E. coli регулируется, по крайней мере, на трех уровнях: 1) инициация синхронизирована с клеточным циклом; 2) синтез ДНК в каждой области начала репликации в клеточном цикле инициируется только один раз; 3) инициация происходит синхронно во всех областях начала репликации, присутствующих в данной бактериальной клетке. Установлено, что синтез ДНК начинается после того, как масса бактериальной клетки в расчете на одну область начала репликации достигает определенного значения, названного массой инициации (initiation mass). В качестве основного водителя ритма (пейсмекера), играющего ключевую роль в контроле инициации репликации, в настоящее время рассматривается белок DnaA.

Подавление синтеза белка in vivo сопровождается завершением уже инициированного синтеза ДНК на фоне прекращения новых раундов инициации. Возобновление синтеза белка приводит к инициации репликации после лаг-периода в одну клеточную генерацию. При наличии всех необходимых белков инициация чувствительна к рифампину – специфическому ингибитору бактериальной РНК-полимеразы, что указывает на зависимость инициации от синтеза нетранслируемой РНК.

Роль топологии oriC в инициации репликации . Топоизомераза I и топоизомераза II (ДНК-гираза) поддерживают бактериальную хромосому в негативно суперскрученном состоянии. Приблизительно половина супервитков нейтрализуется гистоноподобными белками HU, IHF и FIS, тогда как остающаяся сверхспирализация бактериальной хромосомы облегчает транскрипцию, репликацию и сайт-специфическую рекомбинацию. Предполагается, что бактериальная хромосома состоит из 40–50 суперскрученных доменов с 25 супервитками на 1 т.п.о. ДНК. В настоящее время отсутствуют точные данные о топологическом состоянии oriC , необходимом для инициации репликации у E. coli. Известно, что мутации в гене топоизомеразы topA супрессируют температурно-чувствительные мутации dnaA (Ts) . Предполагается, что в этих мутантных штаммах топология oriC изменена таким образом, что допускает инициацию репликации при меньших внутриклеточных концентрациях белка DnaA. Кроме того, на важность определенного топологического состояния oriC для инициации указывает факт нарушения инициации у мутантных бактерий с измененным геном gyrB (Ts) , кодирующим B-субъединицу ДНК-гиразы.

Активация репликации транскрипцией. В том случае, если сверхспирализация минихромосом или плазмид, содержащих oriC , недостаточна для инициации их репликации, инициация может происходить при одновременной транскрипции ДНК в окрестностях oriC . Изменение топологии oriC в этом случае может осуществляться за счет образования R-петель (ДНК–РНК-гибрида в двухцепочечной ДНК) или вследствие транскрипции, как таковой, при которой перед транскрибирующей РНК-полимеразой имеет место локальная положительная сверхспирализация ДНК, а вслед за ней – отрицательная. Это облегчает образование открытых комплексов при инициации синтеза ДНК.

^ Роль белка DnaA в регуляции инициации репликации. ~60 минут необходимо бактерии для репликации хромосомной ДНК, разделения дочерних хромосом и подготовки к новому делению. Следовательно, клетки со временем генерации короче этого периода (например при повышенных температурах на богатых питательных средах) должны инициировать репликацию хромосом, предназначенных для последующих делений, до завершения предыдущего раунда репликации. Таким образом, в отдельной клетке может содержаться реплицирующаяся хромосома со множественными точками начала репликации. При этом инициация репликации на множественных областях начала репликации происходит одновременно.

Сверхпродукция DnaA в бактериях приводит к резкому возрастанию частоты инициаций репликации без изменения общей скорости синтеза ДНК, что указывает на DnaA как на позитивный регулятор этого процесса. Среди моделей, объясняющих механизм регуляторного действия белка DnaA наибольшее распространение получила модель титрования DnaA. В соответствии с этой моделью весь вновь синтезируемый белок DnaA связывается (титруется) DnaA-боксами oriC хромосомы. Как только количество молекул инициатора превышает число внутриклеточных DnaA-боксов (все DnaA-боксы оказываются занятыми белком), происходит инициация синтеза ДНК. После запуска инициации на одном oriC наблюдается освобождение молекул DnaA, резкое повышение его внутриклеточной концентрации и синхронная инициация синтеза ДНК на других доступных областях начала репликации. При этом ассоциация с мембранами первой oriC защищает ее от использования в реинициации.

Роль Dam-метилирования в инициации синтеза ДНК. Как уже упоминалось выше, Dam-метилтрансфераза E. coli модифицирует остатки аденина в последовательностях 5"-GATC. В результате репликации молекула ДНК временно превращается из полностью метилированной молекулы в метилированную по одной цепи, что позволяет клетке распознавать вновь синтезированную ДНК. Расположение кластеров Dam-сайтов в oriC энтеробактерий высококонсервативно (см. рис. I.47,а ). Неметилированная или наполовину метилированная плазмидная ДНК в клетках dam-мутантов не реплицируется, хотя и служит субстратом в бесклеточной системе репликации. Репликация хромосомной ДНК у dam-мутантов начинается на oriC , однако контроль репликации нарушен, что проявляется в асинхронности репликации на множественных oriC . Оказалось, что лишь наполовину метилированная, но не полностью метилированная или неметилированная oriC- ДНК специфически связывается с фракцией мембран E. coli in vitro. При этом в быстро растущих клетках 1/3 времени генерации oriC- ДНК находится в наполовину метилированном состоянии, после чего полностью метилируется. То же самое характерно и для промотора гена инициатора DnaA, у которого метилированное наполовину состояние связано с подавлением транскрипции гена. В отличие от этого реметилирование вновь синтезированной цепи ДНК остальной части бактериальной хромосомы происходит быстро – в течение 1–2 мин. На основании такого рода данных высказывается предположение, что в не полностью метилированном состоянии вышеупомянутые последовательности экранированы бактериальными мембранами от контактов с регуляторными белками и не могут участвовать в повторном раунде инициации репликации (период эклипса ). Мутации в гене seqA резко уменьшают время эклипса, что проявляется в асинхронности инициаций репликации. Белок SeqA оказался негативным регулятором инициации репликации, действующим на этапе взаимодействия oriC с бактериальными мембранами.

^ Роль белка SeqA в регуляции репликации бактериальных хромосом. Ген seqA кодирует белок длиной в 181 аминокислотный остаток, инактивация которого летальна для бактериальных клеток. Исследование взаимодействия этого белка с неметилированной, частично и полностью метилированной областями начала репликации методом смещения полос при электрофорезе в полиакриламидном геле показало его предпочтительное связывание с частично метилированными последовательностями. Однако для полной (контекст-зависимой) специфичности его взаимодействия требуется присутствие дополнительных факторов. Действительно, в составе ДНК-белковых комплексов, образованных с участием частично метилированных последовательностей oriC , обнаружен белок с молекулярной массой 24 кДа, который специфически взаимодействует с метилированной цепью ДНК в oriC . Скрининг клонотеки последовательностей E. coli позволил клонировать ген hobH (hemimethylated origin binding), кодирующий этот белок. Мутации по данному гену приводили к частичной утрате бактериальными клетками синхронизации в инициациях репликации, что также косвенно указывает на участие белка HobH в регуляции инициации репликации бактериальных хромосом на ранних стадиях клеточного цикла. Однако истинная роль этого белка в репликации окончательно не известна.

Период эклипса может заканчиваться в результате постепенного завершения метилирования частично метилированной последовательности oriC , находящейся в комплексе с мембранами. Полное метилирование этих последовательностей предотвращает их взаимодействие с мембранами и делает доступными для инициатора DnaA.

^ Терминация репликации. Встреча двух репликативных вилок в конце цикла репликации бактериальной хромосомы сопровождается несколькими событиями, которые необходимы для полного разделения двух образовавшихся бактериальных хромосом до деления клетки. Движение репликативных вилок навстречу друг другу сопровождается гомологичной рекомбинацией между дочерними хроматидами. В том случае, если количество произошедших рекомбинаций нечетное, образуется димер бактериальной хромосомы, тогда как при четном числе рекомбинаций – две катенированные (зацепленные друг за друга) хромосомы. Во втором случае разделение катенанов с помощью топоизомеразы IV приводит к полному разделению дочерних хромосом, тогда как в случае димера бактериальной хромосомы этого недостаточно. Разделение димера с образованием мономеров происходит в результате сайт-специфической рекомбинации в локусе dif под действием резольвазы (сайт-специфической рекомбиназы) XerCD.
^

4.2.2.Регуляция репликации плазмиды ColE1

Многие клетки прокариот в дополнение к основной хромосоме содержат небольшие внехромосомные ДНК, называемые плазмидами . Плазмиды, размеры которых варьируют от нескольких тысяч до сотен тысяч пар оснований, а число копий на клетку – от одной до нескольких сотен, способны к автономной (независимой от основной хромосомы) репликации и стабильно наследуются в ряду клеточных поколений. Хотя многие плазмиды дают клеткам-хозяевам ощутимые селективные преимущества (устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т.п.), большинство из них являются криптическими , т.е. не проявляющимися в видимом фенотипе клеток. Поскольку их существование – это весомая нагрузка на метаболизм клеток-хозяев, остается непонятным смысл их эволюционной стабильности. Несмотря на то что в природных условиях бактериальные клетки, по-видимому, не испытывают давления отбора, направленного на сохранение плазмид внутри клеток, последние с помощью тонких механизмов, регулирующих число их копий в клетках, стабильно сегрегируют между дочерними бактериальными клетками.

Область начала репликации небольшой плазмиды ColE1, несущей гены устойчивости к колицинам, традиционно используется в генной инженерии при конструировании векторных молекул ДНК, которые находят применение для клонирования и экспрессии в клетках E. coli коротких последовательностей нуклеотидов. Именно поэтому целесообразно рассмотреть механизмы контроля репликации плазмиды ColE1.

^ Инициация репликации плазмиды ColE1. Репликация плазмиды ColE1 происходит в одном направлении (однонаправленная репликация) с использованием репликативного аппарата клетки-хозяина. Сама по себе плазмида не кодирует ни одного фермента, который требовался бы для ее репликации. Область начала репликации содержит два промотора, один из них обеспечивает синтез РНК-праймера (РНК II), необходимого для инициации репликации плазмиды. Синтезированная РНК II, длина которой зависит от типа реплицируемой плазмиды, далее подвергается процессингу с помощью РНКазы H с образованием РНК длиной в 550 нуклеотидов. Эта молекула эффективно используется ДНК-полимеразой I в качестве праймера при синтезе ведущей цепи ДНК. В отсутствие РНКазы H затравкой во время репликации служит 3’-конец РНК II, хотя и с меньшей эффективностью. В клетках, дефектных по РНКазе H и ДНК-полимеразе, инициация репликации ColE1 осуществляется ДНК-полимеразой III с участием РНК II по механизму, подробно рассмотренному выше.

Все три механизма инициации репликации плазмиды основаны на уникальном свойстве РНК II образовывать стабильный ДНК–РНК-гибрид в области начала репликации. Действительно, обычные транскрипты освобождаются из транскрипционного комплекса после завершения транскрипции и отделения РНК-полимеразы от матрицы, чего не происходит с РНК II. Анализ мутантов плазмиды, дефектных по репликации, а также их ревертантов показал, что в стабильном гибриде РНК II с матрицей происходит взаимодействие между G-богатой петлей РНК II, образованной 265 нуклеотидами выше точки инициации репликации (положение –265), и С-богатым участком ДНК, расположенным в окрестностях нуклеотида –20 (рис. I.48,а ). Обе эти последовательности оказались консервативными у родственных плазмид pMB1, p15A и KSF1030. Взаимодействия между указанными последовательностями, по-видимому, происходят в тот момент, когда РНК-полимераза еще находится в транскрипционном комплексе и цепи ДНК в окрестностях комплекса расплетены. Равновесие между двумя альтернативными конформациями РНК II является критическим в определении доли молекул РНК, остающейся в ДНК–РНК-гибриде, необходимом для инициации репликации плазмиды. Выбор между двумя альтернативными конформациями РНК II определяется первичной структурой участка, расположенного между нуклеотидами –359 и –380 (последовательность ) (см. рис. I.48,б ). Эта последовательность может взаимодействовать с выше расположенной комплементарной последовательностью  (структура ) или с гомологичной последовательностью , расположенной ниже (структура ). После того как РНК-полимераза транскрибирует первые 200 нуклеотидов, образовавшаяся РНК II формирует временную вторичную структуру, для которой характерно наличие трех доменов типа "стебель–петля" (I, II и III). Удлинение РНК II еще на несколько нуклеотидов приводит к разрушению стебля III и образованию стебля IV, который стабилизируется в результате комплементарных взаимодействий между последовательностями  и . В течение последующей элонгации РНК II у нее возникают две альтернативные возможности формировать свою вторичную структуру. Выбор в пользу той или иной конформации зависит от того, останется ли последовательность  связанной с последовательностью  или же образует новые контакты с -последовательностью. Переход от комплементарных пар  к  сопровождается сильными изменениями конформации РНК II, которые в конечном счете определяют ее способность служить праймером при репликации плазмиды. Молекулы РНК II в конформации  могут образовывать РНК–ДНК-гибрид, служащий субстратом для РНКазы H, а в конформации  такой способностью не обладают. Предложенная модель подтверждается, прежде всего, тем, что мутации, делающие предпочтительным образование конформации  из-за дестабилизации стебля IV, затрудняют функционирование РНК II в качестве праймера и приводят к понижению числа копий плазмиды ColE1 внутри бактериальных клеток. Такие мутантные плазмиды, дефектные по репликации, активизируются в результате супрессорных мутаций, стабилизирующих стебель IV. Таким образом, инициация репликации плазмиды ColE1 зависит от способности РНК II образовывать РНК–ДНК-гибрид вблизи точки начала репликации (ori). При этом на образование гибрида оказывают влияние вторичная и третичная структуры выше расположенной последовательности нуклеотидов предшественника праймера.

^ Рис. I.48. Схема регуляции репликации плазмиды ColE1

а – предполагаемая вторичная структура РНК II, после транскрибирования РНК-полимеразой  500 нуклеотидов ДНК плазмиды; дальнейшее удлинение РНК II сопровождается образованием ДНК–РНК-гибрида (жирная стрелка) между РНК II и транскрибируемой ДНК;

б – возможный механизм контроля репликации плазмиды. В верхней части рисунка изображена генетическая карта участка ДНК, необходимого для инициации репликации плазмидной ДНК и ее контроля. Схематически представлены пространственные структуры двух ингибиторов репликации плазмиды: РНК I и белка Rop. В нижней части изображены две альтернативные конформации РНК II, образующиеся под действием РНК I, I–X – элементы вторичной структуры
^ Контроль числа копий плазмиды ColE1. Контроль инициации репликации плазмиды ColE1 осуществляется главным образом на уровне изменения пространственной структуры РНК II. Поскольку плазмиды контролируют собственный биосинтез, т.е. их репликация проходит по аутокаталитическому механизму, было постулировано, что инициация репликации ColE1 находится под влиянием ингибитора, кодируемого плазмидой, концентрация которого в клетке тем выше, чем больше число внутриклеточных копий плазмиды. Действительно, анализ механизмов репликации мутантных плазмид, для которых характерна высокая копийность, позволил выявить два транс- действующих фактора, кодируемых плазмидой и оказывающих влияние на репликацию плазмиды in vivo.

Основным ингибитором репликации оказалась небольшая РНК длиной в 108 нуклеотидов, названная РНК I, полностью комплементарная 5’-концевой последовательности предшественника праймера (РНК II). Промотор гена РНК I расположен в области начала репликации плазмиды ColE1 и направлен в противоположную сторону по отношению к промотору РНК II (см. рис. I.48). Комплементарные взаимодействия между РНК I и РНК II оказывают влияние на образование пространственной структуры РНК II таким образом, что предпочтительно возникает конформация βγ, неактивная в отношении инициации репликации (см. рис. I.48,б , внизу справа).

Взаимодействие между РНК I и РНК II происходит продуктивно лишь до тех пор, пока синтезируется короткий транскрипт РНК II длиной не более 80 нуклеотидов. Хотя взаимодействие РНК I с такой короткой последовательностью нуклеотидов происходит медленнее, чем с транскриптом длиной в 360 нуклеотидов, в последнем случае РНК I не оказывает влияния на конформацию 5’-концевой части РНК II и на ее способность функционировать в качестве затравки при репликации плазмиды (конформация αβ, рис. I.48,б , внизу слева). Из этого ясно, что скорость образования гибридов между РНК I и РНК II является определяющей для эффективного функционирования механизма регуляции репликации плазмиды. Процесс взаимодействия РНК I и РНК II в настоящее время детально изучен. Он проходит через образование нескольких промежуточных продуктов и завершается получением стабильного гибрида между полностью комплементарными друг другу РНК I и 5’-концевой областью РНК II.

^ РНК-организующий белок Rop. Ген второго компонента, негативно регулирующего репликацию плазмиды ColE1, картирован непосредственно за областью начала репликации. Этот ген кодирует 63-звенный белок, названный Rop (repressor of primer), существующий в растворе в виде димера. Как in vivo, так и in vitro Rop усиливает ингибирующую активность РНК I, не оказывая влияния на синтез РНК II. При этом Rop влияет на начальные фазы взаимодействия РНК I и РНК II, облегчая переход очень нестабильного промежуточного продукта С* в более стабильный – С m *. Белок Rop обладает высоким сродством к С* и лишь слабо взаимодействует с изолированными РНК I и РНК II in vitro. Предполагают, что Rop проявляет незначительную специфичность в отношении последовательностей нуклеотидов и распознает некоторые общие особенности структуры комплекса РНК I–РНК II, возникающего на ранних этапах их взаимодействия. Таким образом, функции белка Rop, по-видимому, заключаются в преобразовании нестабильного комплекса РНК–РНК в более стабильный, что, в свою очередь, сопровождается подавлением формирования праймера, необходимого для инициации репликации плазмиды ColE1.

Использование антисмысловых РНК в контроле репликации бактериальных плазмид является распространенным приемом. В частности, репликация небольшой, низкокопийной плазмиды R1 контролируется белком RepA, который участвует в инициации репликации плазмиды в качестве позитивного регуляторного фактора. Синтез RepA, в свою очередь, регулируется посттранскрипционно с помощью небольшой антисмысловой РНК CopA, которая связывается с RepA-мРНК в результате многоступенчатой реакции, напоминающей образование гибрида между РНК I и РНК II, рассмотренное выше. Такое взаимодействие подавляет экспрессию гена repA , возможно, вследствие расщепления РНК–РНК-дуплекса РНКазой III. Внутриклеточная концентрация антисмысловой CopA-РНК прямо пропорциональна числу копий плазмиды R1. Аналогичный механизм описан и для регуляции инициации репликации плазмиды pT181 Staphylococcus aurеus.

При получении бактериальных векторов для генной инженерии, многие из которых содержат область начала репликации плазмиды ColE1, с целью повышения числа их копий в бактериальных клетках часто используют ингибиторы биосинтеза белка, в частности хлорамфеникол. После обсуждения механизмов регуляции контроля репликации этой плазмиды становятся понятными принципы, на которых основан данный прием. Действительно, внесение в культуральную среду хлорамфеникола блокирует биосинтез бактериальных белков, в том числе, и белка Rop, который необходим для эффективного подавления инициации репликации плазмиды под действием РНК I. В результате нарушается контроль копийности плазмид в бактериальных клетках, и они начинают непрерывно реплицироваться, используя для этой цели предварительно синтезированные бактериальные белки.

Известно, что две фенотипически различающиеся плазмиды, использующие одинаковый механизм контроля репликации, несовместимы в одной бактериальной клетке. Клетки, содержащие две плазмиды из разных групп совместимости, в процессе размножения быстро образуют две популяции, каждая из которых содержит только один тип плазмид. Это происходит вследствие случайного выбора плазмид для репликации внутри бактериальных клеток и случайного распределения исходного пула плазмид по дочерним клеткам. Эволюционное возникновение механизма контроля репликации бактериальных плазмид с использованием антисмысловых РНК расширило возможности появления плазмид, принадлежащих к разным группам совместимости и сосуществующих в одних и тех же бактериальных клетках. Действительно, несмотря на использование одного и того же механизма, антисмысловые РНК, обладающие разными последовательностями нуклеотидов, не смогут узнавать "чужие," гетерологичные РНК-мишени. Это позволяет таким плазмидам сосуществовать в одной бактериальной клетке и создает условия для их более широкого распространения в природных популяциях микроорганизмов.

Подробное рассмотрение молекулярных механизмов регуляции репликации ДНК выходит за рамки книги, поэтому ограничимся несколькими замечаниями по данному вопросу и более детально обсудим лишь механизм регуляции репликации у E. coli, в том числе и бактериальных плазмид, что имеет непосредственное отношение к функционированию плазмидных векторов в бактериальных клетках.

Синтез ДНК тесно связан с другими процессами, подготавливающими деление клеток, так как передача необходимой генетической информации родительских клеток дочерним является для клеток-потомков жизненно важной. Наличие избыточной генетической информации отрицательно сказывается на жизнеспособности клеток, тогда как недостаток ее, возникающий вследствие недорепликации ДНК, приводит к летальному эффекту из-за отсутствия жизненно важных генов. Однако процесс передачи генетической информации от родительских клеток дочерним у эукариот не ограничивается простой редупликацией ДНК хромосом. Так, для насекомых многих видов характерно наличие гигантских политенных хромосом, которые возникают в результате множественных раундов репликации ДНК исходных хроматид, не сопровождающейся их расхождением.

Политенизация хромосом представляет обширный класс генетических явлений, связанных с избирательной избыточной репликацией (мультипликацией ) или недорепликацией отдельных генетических локусов эукариот. Ярким примером такого рода является изменение числа генов рибосомных РНК у животных. Амплификация генов рРНК в ооцитах амфибий происходит путем образования их внехромосомных (экстрахромосомных) копий в виде кольцевых молекул рибосомных (р) ДНК, которые далее реплицируются по механизму "катящегося кольца". При этом в каждой клетке амплифицируется только по одному из сотен повторов рДНК, так что амплификация рДНК на одном повторе каким-то образом подавляет процесс амплификации на других, и все образовавшиеся повторы одного ооцита идентичны, но отличаются от наборов амплифицированных рДНК других ооцитов. Строгая стадие- и тканеспецифичность, а также избирательная амплификация только одного повтора рДНК указывают на наличие тонких регуляторных механизмов процесса репликации и в этом случае.

Характерными примерами возрастания числа генов вследствие их избирательной репликации являются магнификация генов рРНК и изменение числа генов, определяющих устойчивость клеток к лекарственным препаратам. В первом случае утрата части генов рРНК у дрозофилы в результате делеции сопровождается постепенным восстановлением их числа, тогда как во втором случае у клеток, находящихся в условиях селективного действия токсичного для них лекарственного препарата, возрастает число копий генов, необходимых для его нейтрализации. В частности, это характерно для гена дигидрофолатредуктазы в присутствии метотрексата. Высказывается предположение, что в основе изменения числа копий таких генов лежит механизм неравного кроссинговера.

Репликация хромосом бактерий тесно сопряжена с метаболизмом клеток. Например, частота инициаций новых раундов репликации зависит от скорости роста бактериальных клеток, и в клетках быстро растущих бактерий могут содержаться хромосомы с несколькими работающими репликативными вилками, хотя для репликации одной бактериальной хромосомы их требуется только две, инициированные в единственной области начала репликации (ori) и расходящиеся в противоположных направлениях. Это позволяет бактериям при благоприятных условиях затратить для генерации меньше времени, чем для полной репликации бактериальной хромосомы. Очевидно, что для поддержания строго упорядоченного характера репликации должны существовать тонкие механизмы регуляции репликации на уровне инициации новых раундов. Такие механизмы, действительно, существуют.

Наиболее хорошо изученными в настоящее время являются механизмы регуляции синтеза ДНК у E. coli, в том числе механизмы контроля числа копий у небольшой плазмиды E. coli ColE1, которые будут рассмотрены ниже более подробно из-за важности этих явлений для генной инженерии.

4.2.1.Инициация репликации ДНК у E. coli и ее регуляция

Репликация хромосомной ДНК у бактерий играет ключевую роль в их жизненном цикле. В ходе этого процесса микроорганизмы редуплицируют свой геном, а образовавшиеся дочерние геномы далее переходят в дочерние клетки. Высокая точность, с которой бактерии осуществляют такие процессы, указывает на наличие специальных механизмов их координации и контроля.

Структура области начала репликации oriC . Хромосома E. coli содержит единственную область начала репликации (origin), названную oriC , на которой происходит инициация репликации (рис. I.47,а ). Размер минимальной области начала репликации, обеспечивающей автономную репликацию хромосомы, составляет 258 п.о. (положение 11–268 на рис. I.47). Сравнение первичных структур областей начала репликации различных энтеробактерий показало, что их последовательности представлены короткими консервативными участками, которые перемежаются дивергировавшими сегментами ДНК, длины которых, однако, высококонсервативны. Консервативные участки оказались сайтами связывания регуляторных белков, разделенных спейсерными последовательностями. OriC содержит пять консенсусных 9-нуклеотидных сайтов связывания инициатора DnaA (непалиндромные повторы), названных DnaA-боксами. У всех энтеробактерий области начала репликации содержат 9–14 сайтов GATC, положение восьми из которых консервативно.

В левой части oriC находится AT-богатая область, содержащая три похожих последовательности длиной в 13 нуклеотидов, каждая из которых начинается с GATC. Здесь же локализован AT-кластер, который вместе с левой 13-нуклеотидной последовательностью образует область нестабильной спирали ДНК (ДНК-расплетающий элемент ). Этот участок ДНК может быть заменен без потери функции на аналогичный по нуклеотидному составу, но с другой последовательностью нуклеотидов.

OriC содержит сайты связывания белков, изгибающих ДНК, IHF (integration host factor) и FIS (factor for inversion stimulation). Оба белка, по-видимому, помогают инициатору DnaA раскручивать ДНК.

Димерный белок IciA, состоящий из субъединиц с молекулярной массой 33 кДа, специфически связывается с AT-богатыми 13-мерными повторами. Функция этого белка неизвестна, так же как и функция белка Rob, который специфически взаимодействует с 26-нуклеотидным сайтом в правой части DnaA-бокса R4. ДНК вблизи Rob-сайта обнаруживает изгиб, который более ярко выражен у молекул, полностью метилированных Dam-метилтрансферазой (см. ниже). С такими полностью метилированными ДНК взаимодействует гистоноподобный белок H-NS, сайт связывания которого перекрывается с Rob-сайтом. Это взаимодействие оказывает влияние на функционирование oriC .

Рис. I.47. Структура области начала репликации хромосомы E. coli (а ) и схема инициации ее репликации (б )

HobH – белок, взаимодействующий с метилированной по одной цепи ДНК области начала репликации (hemimethylated origin binding)

Функции белка DnaA. Белок DnaA играет ключевую роль в сборке реплисомы – многокомпонентного белкового комплекса, осуществляющего двунаправленный синтез ДНК. Белок распознает область начала репликации и привлекает к месту сборки остальные белковые компоненты реплисомы.

Этапы инициации синтеза ДНК на oriC . Сборка исходного комплекса начинается с взаимодействия белка DnaA с DnaA-боксами R1–R4 и M (см. рис. I.47,б ). Для успешного прохождения последующих этапов сборки реплисомы белок DnaA должен находиться в комплексе с ATP и взаимодействовать с сверхспирализованным oriC. С помощью электронного микроскопа исходный комплекс обнаруживается в виде компактной эллипсоидной структуры, содержащей 20 мономеров DnaA, которая закрывает oriC. Исходный комплекс обладает высокоупорядоченной структурой.

В присутствии ATP в высокой концентрации (5 мМ) исходный комплекс превращается в открытый комплекс . В этом комплексе происходит частичное расплетение АТ-богатых 13-нуклеотидных повторов, расположенных в левой части oriC . При 37 ° или выше единственный белок DnaA может обеспечивать расплетение ДНК. Для образования открытого комплекса при более низких температурах требуется участие структурирующего белка HU или интеграционного фактора бактерии-хозяина IHF. В открытом комплексе обнаруживают небольшие участки расплетенной ДНК в правой части oriC между DnaA-боксами R2 и R4, которые рассматривают как места посадки хеликазы.

Белок DnaB является хеликазой репликативной вилки и входит в открытый комплекс с образованием препраймирующего комплекса I , взаимодействуя с одноцепочечными участками частично расплетенной ДНК. Такие участки подготавливаются белком DnaA, который вытесняет SSB-белок с соответствующих сайтов. DnaB входит в препраймирующий комплекс I в виде гексамеров, образовавших комплекс с шестью мономерами DnaC, каждый из которых связывает одну молекулу ATP. В этом комплексе хеликазная активность белка DnaB блокирована. Освобождение DnaC из комплекса происходит в результате гидролиза ATP. Следствием этого является активация хеликазы DnaB и ее правильное расположение в комплексе. Совокупность этих событий превращает препраймирующий комплекс I в препраймирующий комплекс II .

Хеликаза должна начать функционировать в месте старта репликативной вилки в правой части oriC вблизи DnaA-боксов R2, R3 и R4. Для этого она должна быть транслоцирована от места ее первоначального вхождения в комплекс к точке начала репликации. Предполагается, что транслокация ассоциирована с ATP-зависимым освобождением из комплекса белка DnaC, что сопровождается активацией хеликазы.

В праймирующем комплексе хеликаза DnaB взаимодействует с DnaG-праймазой, которая играет ключевую роль в обеспечении инициации репликации именно на oriC . Оба этих фермента обеспечивают сопряжение функционирования двух репликативных вилок, движущихся в противоположные стороны. В бесклеточной системе при низких концентрациях праймазы репликация становится однонаправленной и может инициироваться не на oriC . В праймирующем комплексе присутствие белка DnaA больше не требуется, и он после освобождения из комплекса может быть повторно использован для инициации репликации на другом oriC . Полагают, что во время координированной сборки двух репликативных вилок в одной из них синтезируется праймер, который становится затравкой при синтезе ведущей цепи другой репликативной вилкой, движущейся в противоположном направлении. Праймаза в праймирующем комплексе функционирует по дистрибутивному механизму. После синтеза праймеров она покидает репликативную вилку и заменяется новой молекулой праймазы во время образования очередного фрагмента Оказаки.

При образовании реплисомы в каждой репликативной вилке происходит ATP-зависимое формирование димерного комплекса холофермента ДНК-полимеразы III, связанного с 3"-концами праймеров (скользящий зажим, см. выше). Вслед за этим происходит координированная элонгация праймеров, сопровождаемая двунаправленным синтезом ведущих и отстающих цепей ДНК. В бесклеточной системе точки начала синтеза ведущих цепей локализованы в oriC вблизи DnaA-боксов R2, R3 и R4.

Механизмы контроля инициации репликации in vivo. Инициация репликации ДНК у E. coli регулируется, по крайней мере, на трех уровнях: 1) инициация синхронизирована с клеточным циклом; 2) синтез ДНК в каждой области начала репликации в клеточном цикле инициируется только один раз; 3) инициация происходит синхронно во всех областях начала репликации, присутствующих в данной бактериальной клетке. Установлено, что синтез ДНК начинается после того, как масса бактериальной клетки в расчете на одну область начала репликации достигает определенного значения, названного массой инициации (initiation mass). В качестве основного водителя ритма (пейсмекера), играющего ключевую роль в контроле инициации репликации, в настоящее время рассматривается белок DnaA.

Подавление синтеза белка in vivo сопровождается завершением уже инициированного синтеза ДНК на фоне прекращения новых раундов инициации. Возобновление синтеза белка приводит к инициации репликации после лаг-периода в одну клеточную генерацию. При наличии всех необходимых белков инициация чувствительна к рифампину – специфическому ингибитору бактериальной РНК-полимеразы, что указывает на зависимость инициации от синтеза нетранслируемой РНК.

Роль топологии oriC в инициации репликации . Топоизомераза I и топоизомераза II (ДНК-гираза) поддерживают бактериальную хромосому в негативно суперскрученном состоянии. Приблизительно половина супервитков нейтрализуется гистоноподобными белками HU, IHF и FIS, тогда как остающаяся сверхспирализация бактериальной хромосомы облегчает транскрипцию, репликацию и сайт-специфическую рекомбинацию. Предполагается, что бактериальная хромосома состоит из 40–50 суперскрученных доменов с 25 супервитками на 1 т.п.о. ДНК. В настоящее время отсутствуют точные данные о топологическом состоянии oriC , необходимом для инициации репликации у E. coli. Известно, что мутации в гене топоизомеразы topA супрессируют температурно-чувствительные мутации dnaA(Ts) . Предполагается, что в этих мутантных штаммах топология oriC изменена таким образом, что допускает инициацию репликации при меньших внутриклеточных концентрациях белка DnaA. Кроме того, на важность определенного топологического состояния oriC для инициации указывает факт нарушения инициации у мутантных бактерий с измененным геном gyrB(Ts) , кодирующим B-субъединицу ДНК-гиразы.

Активация репликации транскрипцией. В том случае, если сверхспирализация минихромосом или плазмид, содержащих oriC , недостаточна для инициации их репликации, инициация может происходить при одновременной транскрипции ДНК в окрестностях oriC . Изменение топологии oriC в этом случае может осуществляться за счет образования R-петель (ДНК–РНК-гибрида в двухцепочечной ДНК) или вследствие транскрипции, как таковой, при которой перед транскрибирующей РНК-полимеразой имеет место локальная положительная сверхспирализация ДНК, а вслед за ней – отрицательная. Это облегчает образование открытых комплексов при инициации синтеза ДНК.

Роль белка DnaA в регуляции инициации репликации. ~60 минут необходимо бактерии для репликации хромосомной ДНК, разделения дочерних хромосом и подготовки к новому делению. Следовательно, клетки со временем генерации короче этого периода (например при повышенных температурах на богатых питательных средах) должны инициировать репликацию хромосом, предназначенных для последующих делений, до завершения предыдущего раунда репликации. Таким образом, в отдельной клетке может содержаться реплицирующаяся хромосома со множественными точками начала репликации. При этом инициация репликации на множественных областях начала репликации происходит одновременно.

Сверхпродукция DnaA в бактериях приводит к резкому возрастанию частоты инициаций репликации без изменения общей скорости синтеза ДНК, что указывает на DnaA как на позитивный регулятор этого процесса. Среди моделей, объясняющих механизм регуляторного действия белка DnaA наибольшее распространение получила модель титрования DnaA. В соответствии с этой моделью весь вновь синтезируемый белок DnaA связывается (титруется) DnaA-боксами oriC хромосомы. Как только количество молекул инициатора превышает число внутриклеточных DnaA-боксов (все DnaA-боксы оказываются занятыми белком), происходит инициация синтеза ДНК. После запуска инициации на одном oriC наблюдается освобождение молекул DnaA, резкое повышение его внутриклеточной концентрации и синхронная инициация синтеза ДНК на других доступных областях начала репликации. При этом ассоциация с мембранами первой oriC защищает ее от использования в реинициации.

Роль Dam-метилирования в инициации синтеза ДНК. Как уже упоминалось выше, Dam-метилтрансфераза E. coli модифицирует остатки аденина в последовательностях 5"-GATC. В результате репликации молекула ДНК временно превращается из полностью метилированной молекулы в метилированную по одной цепи, что позволяет клетке распознавать вновь синтезированную ДНК. Расположение кластеров Dam-сайтов в oriC энтеробактерий высококонсервативно (см. рис. I.47,а ). Неметилированная или наполовину метилированная плазмидная ДНК в клетках dam-мутантов не реплицируется, хотя и служит субстратом в бесклеточной системе репликации. Репликация хромосомной ДНК у dam-мутантов начинается на oriC , однако контроль репликации нарушен, что проявляется в асинхронности репликации на множественных oriC. Оказалось, что лишь наполовину метилированная, но не полностью метилированная или неметилированная oriC- ДНК специфически связывается с фракцией мембран E. coli in vitro. При этом в быстро растущих клетках 1/3 времени генерации oriC- ДНК находится в наполовину метилированном состоянии, после чего полностью метилируется. То же самое характерно и для промотора гена инициатора DnaA, у которого метилированное наполовину состояние связано с подавлением транскрипции гена. В отличие от этого реметилирование вновь синтезированной цепи ДНК остальной части бактериальной хромосомы происходит быстро – в течение 1–2 мин. На основании такого рода данных высказывается предположение, что в не полностью метилированном состоянии вышеупомянутые последовательности экранированы бактериальными мембранами от контактов с регуляторными белками и не могут участвовать в повторном раунде инициации репликации (период эклипса ). Мутации в гене seqA резко уменьшают время эклипса, что проявляется в асинхронности инициаций репликации. Белок SeqA оказался негативным регулятором инициации репликации, действующим на этапе взаимодействия oriC с бактериальными мембранами.

Роль белка SeqA в регуляции репликации бактериальных хромосом. Ген seqA кодирует белок длиной в 181 аминокислотный остаток, инактивация которого летальна для бактериальных клеток. Исследование взаимодействия этого белка с неметилированной, частично и полностью метилированной областями начала репликации методом смещения полос при электрофорезе в полиакриламидном геле показало его предпочтительное связывание с частично метилированными последовательностями. Однако для полной (контекст-зависимой) специфичности его взаимодействия требуется присутствие дополнительных факторов. Действительно, в составе ДНК-белковых комплексов, образованных с участием частично метилированных последовательностей oriC , обнаружен белок с молекулярной массой 24 кДа, который специфически взаимодействует с метилированной цепью ДНК в oriC . Скрининг клонотеки последовательностей E. coli позволил клонировать ген hobH (hemimethylated origin binding), кодирующий этот белок. Мутации по данному гену приводили к частичной утрате бактериальными клетками синхронизации в инициациях репликации, что также косвенно указывает на участие белка HobH в регуляции инициации репликации бактериальных хромосом на ранних стадиях клеточного цикла. Однако истинная роль этого белка в репликации окончательно не известна.

Период эклипса может заканчиваться в результате постепенного завершения метилирования частично метилированной последовательности oriC , находящейся в комплексе с мембранами. Полное метилирование этих последовательностей предотвращает их взаимодействие с мембранами и делает доступными для инициатора DnaA.

Терминация репликации. Встреча двух репликативных вилок в конце цикла репликации бактериальной хромосомы сопровождается несколькими событиями, которые необходимы для полного разделения двух образовавшихся бактериальных хромосом до деления клетки. Движение репликативных вилок навстречу друг другу сопровождается гомологичной рекомбинацией между дочерними хроматидами. В том случае, если количество произошедших рекомбинаций нечетное, образуется димер бактериальной хромосомы, тогда как при четном числе рекомбинаций – две катенированные (зацепленные друг за друга) хромосомы. Во втором случае разделение катенанов с помощью топоизомеразы IV приводит к полному разделению дочерних хромосом, тогда как в случае димера бактериальной хромосомы этого недостаточно. Разделение димера с образованием мономеров происходит в результате сайт-специфической рекомбинации в локусе dif под действием резольвазы (сайт-специфической рекомбиназы) XerCD.

4.2.2.Регуляция репликации плазмиды ColE1

Многие клетки прокариот в дополнение к основной хромосоме содержат небольшие внехромосомные ДНК, называемые плазмидами . Плазмиды, размеры которых варьируют от нескольких тысяч до сотен тысяч пар оснований, а число копий на клетку – от одной до нескольких сотен, способны к автономной (независимой от основной хромосомы) репликации и стабильно наследуются в ряду клеточных поколений. Хотя многие плазмиды дают клеткам-хозяевам ощутимые селективные преимущества (устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т.п.), большинство из них являются криптическими , т.е. не проявляющимися в видимом фенотипе клеток. Поскольку их существование – это весомая нагрузка на метаболизм клеток-хозяев, остается непонятным смысл их эволюционной стабильности. Несмотря на то что в природных условиях бактериальные клетки, по-видимому, не испытывают давления отбора, направленного на сохранение плазмид внутри клеток, последние с помощью тонких механизмов, регулирующих число их копий в клетках, стабильно сегрегируют между дочерними бактериальными клетками.

Область начала репликации небольшой плазмиды ColE1, несущей гены устойчивости к колицинам, традиционно используется в генной инженерии при конструировании векторных молекул ДНК, которые находят применение для клонирования и экспрессии в клетках E. coli коротких последовательностей нуклеотидов. Именно поэтому целесообразно рассмотреть механизмы контроля репликации плазмиды ColE1.

Инициация репликации плазмиды ColE1. Репликация плазмиды ColE1 происходит в одном направлении (однонаправленная репликация) с использованием репликативного аппарата клетки-хозяина. Сама по себе плазмида не кодирует ни одного фермента, который требовался бы для ее репликации. Область начала репликации содержит два промотора, один из них обеспечивает синтез РНК-праймера (РНК II), необходимого для инициации репликации плазмиды. Синтезированная РНК II, длина которой зависит от типа реплицируемой плазмиды, далее подвергается процессингу с помощью РНКазы H с образованием РНК длиной в 550 нуклеотидов. Эта молекула эффективно используется ДНК-полимеразой I в качестве праймера при синтезе ведущей цепи ДНК. В отсутствие РНКазы H затравкой во время репликации служит 3’-конец РНК II, хотя и с меньшей эффективностью. В клетках, дефектных по РНКазе H и ДНК-полимеразе, инициация репликации ColE1 осуществляется ДНК-полимеразой III с участием РНК II по механизму, подробно рассмотренному выше.

Все три механизма инициации репликации плазмиды основаны на уникальном свойстве РНК II образовывать стабильный ДНК–РНК-гибрид в области начала репликации. Действительно, обычные транскрипты освобождаются из транскрипционного комплекса после завершения транскрипции и отделения РНК-полимеразы от матрицы, чего не происходит с РНК II. Анализ мутантов плазмиды, дефектных по репликации, а также их ревертантов показал, что в стабильном гибриде РНК II с матрицей происходит взаимодействие между G-богатой петлей РНК II, образованной 265 нуклеотидами выше точки инициации репликации (положение –265), и С-богатым участком ДНК, расположенным в окрестностях нуклеотида –20 (рис. I.48,а ). Обе эти последовательности оказались консервативными у родственных плазмид pMB1, p15A и KSF1030. Взаимодействия между указанными последовательностями, по-видимому, происходят в тот момент, когда РНК-полимераза еще находится в транскрипционном комплексе и цепи ДНК в окрестностях комплекса расплетены. Равновесие между двумя альтернативными конформациями РНК II является критическим в определении доли молекул РНК, остающейся в ДНК–РНК-гибриде, необходимом для инициации репликации плазмиды. Выбор между двумя альтернативными конформациями РНК II определяется первичной структурой участка, расположенного между нуклеотидами –359 и –380 (последовательность ) (см. рис. I.48,б ). Эта последовательность может взаимодействовать с выше расположенной комплементарной последовательностью  (структура ) или с гомологичной последовательностью , расположенной ниже (структура ). После того как РНК-полимераза транскрибирует первые 200 нуклеотидов, образовавшаяся РНК II формирует временную вторичную структуру, для которой характерно наличие трех доменов типа "стебель–петля" (I, II и III). Удлинение РНК II еще на несколько нуклеотидов приводит к разрушению стебля III и образованию стебля IV, который стабилизируется в результате комплементарных взаимодействий между последовательностями  и . В течение последующей элонгации РНК II у нее возникают две альтернативные возможности формировать свою вторичную структуру. Выбор в пользу той или иной конформации зависит от того, останется ли последовательность  связанной с последовательностью  или же образует новые контакты с -последовательностью. Переход от комплементарных пар  к  сопровождается сильными изменениями конформации РНК II, которые в конечном счете определяют ее способность служить праймером при репликации плазмиды. Молекулы РНК II в конформации  могут образовывать РНК–ДНК-гибрид, служащий субстратом для РНКазы H, а в конформации  такой способностью не обладают. Предложенная модель подтверждается, прежде всего, тем, что мутации, делающие предпочтительным образование конформации  из-за дестабилизации стебля IV, затрудняют функционирование РНК II в качестве праймера и приводят к понижению числа копий плазмиды ColE1 внутри бактериальных клеток. Такие мутантные плазмиды, дефектные по репликации, активизируются в результате супрессорных мутаций, стабилизирующих стебель IV. Таким образом, инициация репликации плазмиды ColE1 зависит от способности РНК II образовывать РНК–ДНК-гибрид вблизи точки начала репликации (ori). При этом на образование гибрида оказывают влияние вторичная и третичная структуры выше расположенной последовательности нуклеотидов предшественника праймера.

Рис. I.48. Схема регуляции репликации плазмиды ColE1

а – предполагаемая вторичная структура РНК II, после транскрибирования РНК-полимеразой  500 нуклеотидов ДНК плазмиды; дальнейшее удлинение РНК II сопровождается образованием ДНК–РНК-гибрида (жирная стрелка) между РНК II и транскрибируемой ДНК;

б – возможный механизм контроля репликации плазмиды. В верхней части рисунка изображена генетическая карта участка ДНК, необходимого для инициации репликации плазмидной ДНК и ее контроля. Схематически представлены пространственные структуры двух ингибиторов репликации плазмиды: РНК I и белка Rop. В нижней части изображены две альтернативные конформации РНК II, образующиеся под действием РНК I, I–X – элементы вторичной структуры

Контроль числа копий плазмиды ColE1. Контроль инициации репликации плазмиды ColE1 осуществляется главным образом на уровне изменения пространственной структуры РНК II. Поскольку плазмиды контролируют собственный биосинтез, т.е. их репликация проходит по аутокаталитическому механизму, было постулировано, что инициация репликации ColE1 находится под влиянием ингибитора, кодируемого плазмидой, концентрация которого в клетке тем выше, чем больше число внутриклеточных копий плазмиды. Действительно, анализ механизмов репликации мутантных плазмид, для которых характерна высокая копийность, позволил выявить два транс- действующих фактора, кодируемых плазмидой и оказывающих влияние на репликацию плазмиды in vivo.

Основным ингибитором репликации оказалась небольшая РНК длиной в 108 нуклеотидов, названная РНК I, полностью комплементарная 5’-концевой последовательности предшественника праймера (РНК II). Промотор гена РНК I расположен в области начала репликации плазмиды ColE1 и направлен в противоположную сторону по отношению к промотору РНК II (см. рис. I.48). Комплементарные взаимодействия между РНК I и РНК II оказывают влияние на образование пространственной структуры РНК II таким образом, что предпочтительно возникает конформация βγ, неактивная в отношении инициации репликации (см. рис. I.48,б , внизу справа).

Взаимодействие между РНК I и РНК II происходит продуктивно лишь до тех пор, пока синтезируется короткий транскрипт РНК II длиной не более 80 нуклеотидов. Хотя взаимодействие РНК I с такой короткой последовательностью нуклеотидов происходит медленнее, чем с транскриптом длиной в 360 нуклеотидов, в последнем случае РНК I не оказывает влияния на конформацию 5’-концевой части РНК II и на ее способность функционировать в качестве затравки при репликации плазмиды (конформация αβ, рис. I.48,б , внизу слева). Из этого ясно, что скорость образования гибридов между РНК I и РНК II является определяющей для эффективного функционирования механизма регуляции репликации плазмиды. Процесс взаимодействия РНК I и РНК II в настоящее время детально изучен. Он проходит через образование нескольких промежуточных продуктов и завершается получением стабильного гибрида между полностью комплементарными друг другу РНК I и 5’-концевой областью РНК II.

РНК-организующий белок Rop. Ген второго компонента, негативно регулирующего репликацию плазмиды ColE1, картирован непосредственно за областью начала репликации. Этот ген кодирует 63-звенный белок, названный Rop (repressor of primer), существующий в растворе в виде димера. Как in vivo, так и in vitro Rop усиливает ингибирующую активность РНК I, не оказывая влияния на синтез РНК II. При этом Rop влияет на начальные фазы взаимодействия РНК I и РНК II, облегчая переход очень нестабильного промежуточного продукта С* в более стабильный – С m *. Белок Rop обладает высоким сродством к С* и лишь слабо взаимодействует с изолированными РНК I и РНК II in vitro. Предполагают, что Rop проявляет незначительную специфичность в отношении последовательностей нуклеотидов и распознает некоторые общие особенности структуры комплекса РНК I–РНК II, возникающего на ранних этапах их взаимодействия. Таким образом, функции белка Rop, по-видимому, заключаются в преобразовании нестабильного комплекса РНК–РНК в более стабильный, что, в свою очередь, сопровождается подавлением формирования праймера, необходимого для инициации репликации плазмиды ColE1.

Использование антисмысловых РНК в контроле репликации бактериальных плазмид является распространенным приемом. В частности, репликация небольшой, низкокопийной плазмиды R1 контролируется белком RepA, который участвует в инициации репликации плазмиды в качестве позитивного регуляторного фактора. Синтез RepA, в свою очередь, регулируется посттранскрипционно с помощью небольшой антисмысловой РНК CopA, которая связывается с RepA-мРНК в результате многоступенчатой реакции, напоминающей образование гибрида между РНК I и РНК II, рассмотренное выше. Такое взаимодействие подавляет экспрессию гена repA , возможно, вследствие расщепления РНК–РНК-дуплекса РНКазой III. Внутриклеточная концентрация антисмысловой CopA-РНК прямо пропорциональна числу копий плазмиды R1. Аналогичный механизм описан и для регуляции инициации репликации плазмиды pT181 Staphylococcus aurеus.

При получении бактериальных векторов для генной инженерии, многие из которых содержат область начала репликации плазмиды ColE1, с целью повышения числа их копий в бактериальных клетках часто используют ингибиторы биосинтеза белка, в частности хлорамфеникол. После обсуждения механизмов регуляции контроля репликации этой плазмиды становятся понятными принципы, на которых основан данный прием. Действительно, внесение в культуральную среду хлорамфеникола блокирует биосинтез бактериальных белков, в том числе, и белка Rop, который необходим для эффективного подавления инициации репликации плазмиды под действием РНК I. В результате нарушается контроль копийности плазмид в бактериальных клетках, и они начинают непрерывно реплицироваться, используя для этой цели предварительно синтезированные бактериальные белки.

Известно, что две фенотипически различающиеся плазмиды, использующие одинаковый механизм контроля репликации, несовместимы в одной бактериальной клетке. Клетки, содержащие две плазмиды из разных групп совместимости, в процессе размножения быстро образуют две популяции, каждая из которых содержит только один тип плазмид. Это происходит вследствие случайного выбора плазмид для репликации внутри бактериальных клеток и случайного распределения исходного пула плазмид по дочерним клеткам. Эволюционное возникновение механизма контроля репликации бактериальных плазмид с использованием антисмысловых РНК расширило возможности появления плазмид, принадлежащих к разным группам совместимости и сосуществующих в одних и тех же бактериальных клетках. Действительно, несмотря на использование одного и того же механизма, антисмысловые РНК, обладающие разными последовательностями нуклеотидов, не смогут узнавать "чужие," гетерологичные РНК-мишени. Это позволяет таким плазмидам сосуществовать в одной бактериальной клетке и создает условия для их более широкого распространения в природных популяциях микроорганизмов.

Основное функциональное значение процесса репликации ДНК заключается в снабжении потомства генетической информацией. Для обеспечения генетической стабильности организма и вида ДНК должна реплицироваться полностью и с очень высокой точностью. Процесс репликации ДНК весьма сложен. В нем участвует множество ферментов. Первое энзимологическое исследование репликации ДНК было проведено Артуром Корнбергом, открывшим в Escherichia coli фермент, ныне называемый ДНК-полимеразой I. Этот фермент проявляет несколько типов ферментативной активности и характеризуется сложной структурой. В качестве субстратов ДНК-полимераза I использует дезоксирибонуклео-зидтрифосфаты-производные аденина, гуанина, цитозина и тимина. Полимеразная активность, впервые продемонстрированная для ДНК-полимеразы I, свойственна остальным полимеразам прокариотических и эукариотических клеток, при этом важно помнить, что основной функцией ДНК-полимеразы 1 Е. coli, как было установлено, является репарация ДНК.

Инициация синтеза ДНК

Для инициации синтеза ДНК (рис. 38.13) требуются короткие (10-200 нуклеотидов) последовательности РНК, выполняющие функции затравок (праймеров). Синтез начинается с реакции между 3-гидроксильной группой РНК-затравки и а-фосфатной группой дезоксирибонуклеозидтрифосфата, в ходе которой дезоксирибонуклеозидный остаток присоединяется к РНК-затравке с одновременным выщеплением пирофосфата. З-гидроксильная группа присоединенного дезоксирибону-клеозидмонофосфата осуществляет далее нуклеофильную атаку на а-фосфатную группу следующего встраивающегося дезоксирибонуклеозидтрифосфата, также с отщеплением пирофосфата. Естественно, что выбор очередного нуклеотида на каждом шаге синтеза определяется матричной цепью ДНК согласно правилам, предложенным впервые Уотсоном и Криком (рис. 38.14). Так, если в соответствующем положении матричной цепи находится остаток адениндезоксирибонуклеозидмонофосфата, то в реакцию будет вступать тимидинтрифосфат и его а-фосфатная группа будет атаковаться 3-гидроксильной группой последнего остатка растущей цепи. Реакция происходит только в том случае, если встраиваемый нуклеотид образует комплементарную пару с очередным нуклеотидом матричной цепи ДНК и благодаря водородным связям занимает положение, при котором З-гидроксильная группа растущей цепи атакует новый нуклеотид и включает его в полимер. Последовательности ДНК, присоединенные к РНК-затравкам, были названы по имени открывшего их японского ученого - фрагментами Оказаки (рис. 38.15). У млекопитающих после образования значительного числа фрагментов Оказаки репликационный комплекс приступает

(см. скан)

Рис. 38.13. Инициация синтеза ДНК РНК-затравкой и последующее присоединение второго дезоксирибонуклеозидтрифосфата.

Рис. 38.14. Матричная функция ДНК-цепи при инициированном РНК-затравкой синтезе комплементарной цепи.

Рис. 38.15. Прерывистая полимеризация дезоксирибонуклеотидов и образование фрагментов Оказаки.

к удалению РНК-затравок и заполнению образующихся брешей соответствующими дезоксирибо-нуклеотидами. Затем с помощью ДНК-лигазы фрагменты «сшиваются» между собой с образованием непрерывной цепи ДНК.

Полярность репликации

Как уже отмечалось, молекулы ДНК состоят из двух антипараллельных цепей. Репликация ДНК у про- и эукариот происходит одновременно на обеих цепях. Однако фермента, ведущего синтез ДНК в направлении , не существует, и, следовательно, вновь синтезируемые цепи, казалось бы, не могут расти в одном и том же направлении одновременно. Несмотря на это противоречие, один и тот же фермент осуществляет практически синхронный синтез обеих цепей. При этом цепь, синтезируемая в направлении 5-У («лидирующая»), оказывается непрерывной. Синтез второй («отстающей») цепи осуществляется фрагментами по 150-200 нуклеотидов. Очередные акты инициации синтеза этих фрагментов, происходящего в каждый данный момент также в направлении осуществляются по мере общего продвижения репликационной вилки в одном направлении. Схема «полунепрерывного» синтеза ДНК представлена на рис. 38.16.

При репликации ядерной ДНК млекопитающих

Рис. 38.16. Процесс полунепрерывной, одновременной репликации обеих цепей двухцепочечной ДНК.

большая часть РНК-праймеров в конце процесса удаляется, между тем при репликации митохондриального генома небольшие фрагменты РНК остаются интегрированными в замкнутой кольцевой молекуле ДНК.

Ферменты полимеризации и репарации ДНК

В ядрах клеток млекопитающих имеется класс полимераз, так называемых полимераз альфа (Pol а), ответственных за хромосомную репликацию. Одна молекула Pol а способна включать в растущую цепь около 100 нуклеотидов в секунду, таким образом она функционирует примерно в десять раз медленнее, чем бактериальная ДНК-полимераза. Снижение скорости может объясняться помехами со стороны нуклеосом. Как ДНК-полимераза преодолевает нуклеосомы - неизвестно. Однако известно, что после завершения репликации соответствующие нуклеосомы оказываются распределенными случайным образом в обеих дочерних цепях.

В ядрах клеток млекопитающих обнаружена также ДНК-полимераза с меньшей, нежели у Pol а, молекулярной массой-полимераза бета (Pol, которая не участвует в обычном процессе репликации, но необходима для репарации ДНК (см. ниже). Еще одна, митохондриальная, ДНК-полимераза гамма (Polу) осуществляет репликацию кольцевого генома митохондрий.

Полная репликация генома млекопитающих заканчивается за 9 часов-время, необходимое для удвоения генетического материала диплоидной делящейся клетки. Такая скорость свидетельствует о том, что репликация начинается сразу на многих участках, называемых точками начала репликации и обозначаемых ori (от англ. origin - начало). Таких точек (сайтов) насчитывается около 100. Репликация происходит в двух направлениях, и обе цепи реплицируются одновременно. При этом на хромосоме образуются так называемые «репликационные пузыри» (рис. 38.17).

Сайты, выполняющие роль точек начала репликации у эукариот, определены не достаточно четко. Более полные данные в этом плане имеются для дрожжей и нескольких вирусов животных. Можно сказать с уверенностью, что процессы инициации контролируются как в пространственном аспекте, так и во временном, поскольку соседние кластеры инициируются синхронно. Существует представление о том, что функциональные домены хроматина реплицируются как целостные единицы. При этом подразумевается, что точки начала репликации расположены вполне определенным образом по отношению к единицам транскрипции.

Рис. 38.17. Образование «репликационных пузырей» в процессе синтеза ДНК. Показаны двунаправленность репликации и предполагаемое расположение белков, расплетающих цепь, в репликационных вилках.

Рис. 38.18. Гипотетическая схема действия белка, специфичного к одноцепочечной ДНК в репликационной вилке. По мере синтеза второй цепи белок высвобождается и присоединяется к вновь образованным участкам одноцепочечной ДНК. (Courtesy of В. Alberts.)

(см. скан)

Рис. 38.19. Сравнение двух типов реакций, репарирующих одноцепочечные разрывы ДНК. Реакции, представленные слева, катализируются ДНК-лигазой, а представленные справа-ДНК-топоизомеразой. (Slightly modified and reproduced, with permission from Lehninger A. L.: Biochemistry, 2nd ed. Worth, 1975.)

При репликации двухцепочечная ДНК должна разойтись на индивидуальные цепи с тем, чтобы каждая из них могла функционировать в роли матрицы. Разделению цепей ДНК содействуют молекулы специфических белков, стабилизирующих одноцепочечную структуру при продвижении репликационной вилки. Стабилизирующие белки стехиометрически связываются с одиночной цепью, не мешая при этом нуклеотидам выступать в роли матрицы (рис. 38.18). Наряду с разделением цепей должно происходить и раскручивание спирали (1 оборот на каждые 10 нуклеотидов), сопровождаемое скручиванием вновь синтезированных дочерних цепей. Учитывая время, за которое происходит репликация у прокариот, можно рассчитать, что молекула ДНК должна раскручиваться со скоростью 400 000 об/сек, что совершенно невозможно. Следовательно, должны существовать множественные «шарниры», расположенные по всей длине молекулы ДНК. Шарнирные функции выполняет специальный фермент (ДНК-топоизомераза), вносящий разрывы в одну из цепей раскручиваемой двойной спирали. Разрывы быстро зашиваются этим же ферментом без дополнительных энергетических затрат, поскольку необходимая энергия запасается в форме макроэргической ковалентной связи, возникающей между сахарофосфатным остовом цепи ДНК и топоизомеразой. Представленную на рис. 38.19 схему этого процесса можно сравнить с последовательностью событий сшивания разрыва в ДНК, катализируемых ДНК-лигазой. ДНК-топоизомеразы ответственны также за раскручивание суперспирализованной ДНК. Суперспирализованная ДНК - это высокоупорядоченная структура, образуемая кольцевыми или сверх-длинными молекулами ДНК при закручивании вокруг гистонового кора (рис. 38.20).

Один из классов вирусов животных (ретровирусы) обладает ферментами, способными синтезировать молекулу ДНК по матрице РНК. РНК-зависимая ДНК-полимераза, или обратная транскриптаза (таково название этого фермента), сначала синтезирует РНК-ДНК-гибрид, используя рибонуклеиновый геном вируса в качестве матрицы. Затем фермент РНКаза Н удаляет РНК-цепь, а оставшаяся ДНК-цепь в свою очередь служит матрицей для синтеза второй цепи ДНК. Таким образом возникает кДНК-двухцепочечная ДНК-копия, содержащая информацию, первично представленную в виде РНК-генома ретровируса.

Регуляция синтеза ДНК

В клетках животных и человека репликация ДНК происходит только в определенный период жизни клетки. Этот период называется синтетическим (так называемая -фаза). -фаза отделена от митоза предсинтетическим и постсинтетическим периодами (рис. 38.21).

Рис. 38.20. Суперскручивание ДНК. Левозакрученная тороидная (соленоидная) сверхспираль (слева) превращается в правозакрученную при удалении цилиндрического ядра. Аналогичный переход происходит при разрушении нуклеосом в случае экстракции гистонов концентрированными солевыми растворами.

Первичная регуляция клеткой синтеза собственной ДНК заключается в том, что репликация происходит в строго определенное время и в основном в клетках, готовящихся к делению. В регуляции вступления клетки в -фазу участвуют циклические пуриновые нуклеотиды и, возможно, сами субстраты синтеза ДНК. Механизм такой регуляции остается неизвестным. Многие онковирусы способны ослаблять или разрушать внутренние информационные связи, контролирующие вступление клеток в -фазу. И в этом случае механизм остается неясен, хотя, возможно, он включает фо-сфорилирование определенных белковых молекул хозяйской клетки.

В -фазе клетки млекопитающих содержат большее количество полимеразы а, чем в несинтетические периоды клеточного цикла. Кроме того, в -фазе усиливается активность ферментов, участвующих в образовании субстратов синтеза ДНК (дезок-сирибонуклеозидтрифосфатов). Активность этих ферментов падает при выходе из -фазы и остается на низком уровне вплоть до поступления сигнала к возобновлению синтеза ДНК. В -фазе происходит полная и строго однократная репликация ядерной ДНК. Создается впечатление, что реплицированный хроматин каким-то образов маркируется, в результате

Рис. 38.21. Цикл деления клеток млекопитающих. Фаза синтеза ДНК (-фаза) отделена от митоза периодами G, и G,. (Стрелкой указано направление цикла клеточного развития.)

чего создаются помехи для дальнейшей репликации до тех пор, пока клетка не пройдет митоз. Можно предположить, что в качестве такого ковалентного маркера выступают метильные группы (т.е. маркирование ДНК осуществляется за счет ее метилирования).

Как правило, каждая данная пара хромосом реплицируется одновременно и в строго определенный промежуток S-фазы. Природа сигналов, регулирующих синтез ДНК на этом уровне, неизвестна, но, по-видимому, таким механизмом регуляции обладает каждая индивидуальная хромосома.

Деградация и репарация ДНК

Передача наследственной информации в неискаженном виде - важнейшее условие выживания как каждого конкретного организма, так и вида в целом. Следовательно, в ходе эволюции должна была сформироваться система, позволяющая клетке исправлять нарушения ДНК, вызванные ошибками репликации или повреждающими воздействиями окружающей среды. Подсчитано, что в результате повреждений, обусловленных этими причинами, в геноме клеток зародышевой линии человека происходит в среднем шесть нуклеотидных замен в год. По-видимому, в соматических клетках за год происходит примерно такое же число мутаций.

Как описано в гл. 37, основным условием точной репликации является правильное образование пар нуклеотидов. Точность комплементарных взаимодействий зависит от того, находятся ли пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды в благоприятной для спаривания таутомерной форме (рис. 34.7). В равновесии концентрация благоприятных таутомерных форм нуклеотидов превышает концентрацию неблагоприятных таутомеров в 104-105 раз. Этого явно недостаточно для обеспечения безошибочного узнавания. Вот почему в клетках бактерий и млекопитающих существует специальная система мониторинга точности спаривания нуклеотидов. Этот этап проверяется дважды: первый раз - при включении дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в растущую цепь и второй раз - уже после включения, с использованием энергозависимого механизма удаления ошибочно встроенных нуклеотидов из вновь синтезированной нити ДНК. Благодаря такому контролю ошибки включения происходят не чаще чем 1 раз на 108-10е пар оснований. В клетках Е. coli этот механизм обеспечивается ДНК-полимеразой, обладающей активностью. В то же время ДНК-полимеразы млекопитающих не обладают явно выраженной корректирующей нуклеазной активностью.

Физические и химические факторы окружающей среды вызывают в ДНК повреждения четырех типов (см. табл. 38.2). Поврежденные участки могут быть подвергнуты репарации, замещены путем рекомбинации или остаться без изменений. В последнем случае возникают мутации, потенциально ведущие к гибели клетки. Возможность репарации и замещения базируется на избыточности информации закодированной в структуре двухспиральной ДНК: дефектная область одной цепи ДНК может быть исправлена по неповрежденной комплементарной цепи.

Ключевой момент всех рекомбинационных и репарационных событий - распознавание дефекта, сопровождающееся либо непосредственной репарацией, либо маркированием для последующего исправления. Термолабильность N-гликозидной связи пуринов приводит к депуринизации ДНК с частотой около 5000-10000 на клетку (в день) при 37° С. Места депуринизации узнаются специальными ферментами,

Таблица 38.2. Типы повреждений ДНК

специфически заполняющими брешь без разрыва фосфодиэфирного остова молекулы.

Как цитозиновые, так и адениновые основания спонтанно дезаминируются с образованием урацила и гипоксантина соответственно. Поскольку в норме ДНК не содержит ни урацила, ни гипоксантина, нет ничего удивительного в том, что специфические -гликозилазы узнают эти аномальные основания и удаляют их. Образовавшийся разрыв служит сигналом для действия репарационных пурин- или пиримидинспецифичных эндонуклеаз, расщепляющих фосфодиэфирную связь возле соответствующего участка повреждения. После этого при последовательном действии экзонуклеазы, репарационной ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы происходит заполнение бреши и восстановление исходной правильной структуры (рис. 38.22). Эта цепь событий получила название эксцизионной репарации. Сходным образом происходит процесс репарации ДНК, содержащей алкилированные основания и аналоги оснований.

Восстановление делеций и удаление вставок происходит при помощи рекомбинационных процессов, которые могут протекать либо с участием репликации, либо без нее.

Ультрафиолетовое излучение индуцирует образование пиримидин-пиримидиновых димеров.

Рис. 38.22. Фермент урацил-ДНК-гликозилаза удаляет урацил, возникающий при спонтанном дезаминировании цитозина. (Courtesy of В. Alberts.)

Рис. 38.23. Тимин-тиминовый димер, образующийся при связывании рядом расположенных тиминовых оснований.

Этот процесс затрагивает преимущественно расположенные друг под другом тиминовые основания одной цепи (рис. 38.23). Для удаления тиминовых димеров в клетке существуют два механизма: эксцизионная репарация и фотореактивация. Этот способ репарации подразумевает фотоактивацию видимым светом специфического фермента, который обращает процесс, приведший к образованию димерной структуры.

Одноцепочечные разрывы ДНК, вызванные ионизирующей радиацией, могут быть репарированы прямым лигированием или рекомбинацией. Механизмы, вовлеченные в репарацию поперечных сшивок между основаниями противолежащих цепей или между ДНК и белками, изучены недостаточно.

Итак, репарация повреждений, вызванных ионизирующей радиацией и алкилированием оснований, осуществляется путем вырезания и ресинтеза коротких участков ДНК. Удаление повреждений, вызванных ультрафиолетовым облучением, а также поперечных сшивок достигается аналогичным путем, но в этом случае затрагиваются более протяженные участки ДНК. В клетках млекопитающих о протекании репарационной репликации свидетельствует внеплановый синтез ДНК, т.е. включение в ДНК радиоактивных предшественников вне S-фазы.

При интенсификации процессов эксцизионной репарации в ответ на повреждающие воздействия в клетках млекопитающих усиливается активность фермента поли(АОР-рибозил)-полимеразы. Этот фермент при участии кофермента осуществляет реакцию ADP-рибозилирования белков хроматина. В основном происходит моно-ADP-рибозилирование, однако иногда имеет место присоединение гомополимерных цепочек (ADP-рибоза). Функция поли(АОР-рибозил)-полимеразы или ее продукта - (ADP-рибоза), - в процессе эксцизионной репарации не вполне ясна. Наблюдается корреляция во времени между интенсификацией

процессов репарации и увеличением активности фермента. Специфическое ингибирование активности данного фермента препятствует устранению разрывов в цепи ДНК. Увеличение активности poly (ADP-рибозил)полимеразы вызывается, по-видимому, фрагментацией ДНК в ядре. Такая фрагментация может быть индуцирована в первую очередь физическими агентами (например, рентгеновским излучением), кроме того, она может происходить неадекватно интенсивно в ходе репарации ультрафиолетовых повреждений или повреждений, вызванных алкилирующими агентами. Возрастание активности фермента, вызванное разрывами ДНК, бывает настолько велико, что может привести к истощению внутриклеточного запаса кофермента NAD+.

Пигментная ксеродерма-аутосомно-рецессивное наследственное заболевание. Клинический синдром включает чувствительность к солнечному свету (ультрафиолет), что приводит к образованию множества очагов рака кожи и летальному исходу. Это заболевание, по-видимому, связано с нарушениями репарационных процессов. В культивируемых клетках больных пигментной ксеродермой снижена интенсивность фотореактивации тиминовых димеров. Однако собственно генетические нарушения, приводящие к пигментной ксеродерме, насчитывают по меньшей мере 7 комплементационных групп, что указывает на комплексность причин, вызывающих данное заболевание.

При пигментной юсеродерме в клетках большинства (если не всех) комплементационных групп наблюдаются аномалии в скорости и интенсивности ответа поли(АОР-рибозил)-полимеразы на ультрафиолетовое облучение. В клетках по крайней мере одной комплементационной группы снижение активности фермента, по-видимому, связано с неспособностью разрезать цепь ДНК у поврежденного сайта, поскольку добавление к таким дефектным клеткам дезоксирибонуклеазы нормализует уровень активности поли(АОР-рибозил)-полимеразы.

У больных с атаксией - телеангиэктазией (аутосом-но-рецессивное заболевание, приводящее к мозжечковой атаксии и лимфоретикулярной неоплазме) повышена чувствительность к рентгеновскому облучению. У больных анемией Фанкони (аутосомно-рецессивная анемия, сопровождающаяся повышенной частотой онкологических заболеваний и хромосомной нестабильностью), вероятно, нарушена система репарации поперечных сшивок. Для всех трех описанных синдромов характерна повышенная частота возникновения опухолей. Вполне возможно, что в недалеком будущем будут выявлены другие заболевания человека, вызванные нарушениями в системе репарации повреждений ДНК.

ЛИТЕРАТУРА

Bauer W. R. et al. Supercoiled DNA, Sci. Am. (July), 1980, 243, 118.

Cantor C.R. DNA choreography, Cell, 1981, 25, 293. Igo-Kemenes Т., Horz W., Zachau H.G. Chromatin, Annu.

Rev. Biochem., 1982, 51, 89.

Jelinek W. R.. Schmid C. W. Repetitive sequences in eukaryotic DNA and their expression, Annu. Rev. Biochem., 1982,51, 813.

Jongstra J. et al. Induction of altered chromatin structures by simian virus 40 enhancer and promoter elements, Nature, 1984, 307, 708.

Kornberg A. DNA Replication, Freeman, 1980.

Lindahl T. DNA repair enzymes, Annu. Rev. Biochem., 1982, 51, 61.

Loeb L. A., Kunkel T. A. Fidelity of DNA synthesis, Annu. Rev.

Biochem, 1982, 51, 429.

McGhee J. D., Felsenfeld G. Nucleosome structure, Annu. Rev.

Biochem., 1980, 49, 1115.

Nossal N. G. Prokaryotic DNA replication systems, Annu. Rev. Biochem., 1983, 52, 581.

Внеклеточное Биологическая Внутриклеточное пространство мембрана пространство

Возбудители коклюша и паракоклюша. Характеристика их свойств. Патогенез коклюша. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика.

Генетический аппарат бактерий (хромосомы, плазмиды) характеристика бактериальных транспозонов. Биологическая роль плазмид.

Реплика́ция ДНК - процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. Репликацию ДНК осуществляет сложный ферментный комплекс, состоящий из 15-20 различных белков, называемый реплисомой (англ. replisome).

История изучения

Каждая молекула ДНК состоит из одной цепи исходной родительской молекулы и одной вновь синтезированной цепи. Такой механизм репликации называется полуконсервативным. В настоящее время этот механизм считается доказанным благодаря опытам Мэтью Мезельсона и Франклина Сталя (1958 г.). Ранее существовали и две другие модели: «консервативная» - в результате репликации образуется одна молекула ДНК, состоящая только из родительских цепей, и одна, состоящая только из дочерних цепей; «дисперсионная» - все получившиеся в результате репликации молекулы ДНК состоят из цепей, одни участки которых вновь синтезированы, а другие взяты из родительской молекулы ДНК.

Общие представления

Репликация ДНК - ключевое событие в ходе деления клетки. Принципиально, чтобы к моменту деления ДНК была реплицирована полностью и при этом только один раз. Это обеспечивается определёнными механизмами регуляции репликации ДНК. Репликация проходит в три этапа:

инициация репликации

элонгация

терминация репликации.

Регуляция репликации осуществляется в основном на этапе инициации. Это достаточно легко осуществимо, потому что репликация может начинаться не с любого участка ДНК, а со строго определённого, называемого сайтом инициации репликации. В геноме таких сайтов может быть как всего один, так и много. С понятием сайта инициации репликации тесно связано понятие репликон. Репликон - это участок ДНК, который содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта. Геномы бактерий, как правило, представляют собой один репликон, это значит, что репликация всего генома является следствием всего одного акта инициации репликации. Геномы эукариот (а также их отдельные хромосомы) состоят из большого числа самостоятельных репликонов, это значительно сокращает суммарное время репликации отдельной хромосомы. Молекулярные механизмы, которые контролируют количество актов инициации репликации в каждом сайте за один цикл деления клетки, называются контролем копийности. В бактериальных клетках помимо хромосомной ДНК часто содержатся плазмиды, которые представляют собой отдельные репликоны. У плазмид существуют свои механизмы контроля копийности: они могут обеспечивать синтез как всего одной копии плазмиды за клеточный цикл, так и тысяч копий.

Репликация начинается в сайте инициации репликации с расплетания двойной спирали ДНК, при этом формируется репликационная вилка - место непосредственной репликации ДНК. В каждом сайте может формироваться одна или две репликационные вилки в зависимости от того, является ли репликация одно- или двунаправленной. Более распространена двунаправленная репликация. Через некоторое время после начала репликации в электронный микроскоп можно наблюдать репликационный глазок - участок хромосомы, где ДНК уже реплицирована, окружённый более протяжёнными участками нереплицированной ДНК.

В репликационной вилке ДНК копирует крупный белковый комплекс (реплисома), ключевым ферментом которого является ДНК-полимераза. Репликационная вилка движется со скоростью порядка 100 000 пар нуклеотидов в минуту у прокариот и 500-5000 - у эукариот.

Молекулярный механизм репликации

Ферменты (хеликаза, топоизомераза) и ДНК-связывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК. Правильность репликации обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований и активностью ДНК-полимеразы, способной распознать и исправить ошибку. Репликация у эукариот осуществляется несколькими разными ДНК-полимеразами. Далее происходит закручивание синтезированных молекул по принципу суперспирализации и дальнейшей компактизации ДНК. Синтез энергозатратный.

Цепи молекулы ДНК расходятся, образуют репликационную вилку, и каждая из них становится матрицей, на которой синтезируется новая комплементарная цепь. В результате образуются две новые двуспиральные молекулы ДНК, идентичные родительской молекуле.

Характеристики процесса репликации

матричный - последовательность синтезируемой цепи ДНК однозначно определяется последовательностью материнской цепи в соответствии с принципом комплементарности;

полуконсервативный - одна цепь молекулы ДНК, образовавшейся в результате репликации, является вновь синтезированной, а вторая - материнской;

идёт в направлении от 5’-конца новой молекулы к 3’-концу;

полунепрерывный - одна из цепей ДНК синтезируется непрерывно, а вторая - в виде набора отдельных коротких фрагментов (фрагментов Оказаки);

начинается с определённых участков ДНК, которые называются сайтами инициации репликации (англ. origin).

Основные ферменты репликации ДНК

Информация / Репликация ДНК / Основные ферменты репликации ДНК

ДНК – полимераза

ДНК-полимераза - фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется по принципу комплементарности с шаблоном, с которого ведётся считывание. Собираемая молекула комплементарна шаблонной моноспирали и идентична второму компоненту двойной спирали.

Выделяют ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, использующую в качестве матрицы одну из цепей ДНК, и РНК-зависимую ДНК-полимеразу, способную также к считыванию информации с РНК (обратная транскрипция).

ДНК-полимеразу считают холоферментом, поскольку для нормального функционирования она требует присутствия ионов магния в качестве кофактора. В отсутствии ионов магния о ней можно говорить как об апоферментe.

ДНК-полимераза начинает репликацию ДНК, связываясь с отрезком цепи нуклеотидов. Среднее количество нуклеотидов, присоединяемое ферментов ДНК-полимеразой за один акт связывания/диссоциации с матрицей, называют процессивностью.

ДНК – лигазы

Лигаза - фермент, катализирующий соединение двух молекул с образованием новой химической связи (лигирование). При этом обычно происходит отщепление (гидролиз) небольшой химической группы от одной из молекул.

Лигазы относятся к классу ферментов EC 6.

В молекулярной биологии лигазы разделяют на две большие группы - РНК-лигазы и ДНК-лигазы. ДНК-лигаза, осуществляющая репарацию ДНК

ДНК-лигазы - ферменты, катализирующие ковалентное сшивание цепей ДНК в дуплексе при репликации, репарации и рекомбинации. Они образуют фосфодиэфирные мостики между 5"-фосфорильной и 3"-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрыва ДНК или между двумя молекулами ДНК. Для образования этих мостиков лигазы используют энергию гидролиза пирофосфорильной связи АТФ. Один из самых распространённых коммерчески доступных ферментов - ДНК-лигаза бактериофага Т4.

ДНК – геликазы

ДНК геликазы - ферменты раскручивающие двуцепочечную спираль ДНК с затратой энергии гидролиза трифосфатов NTP. Образуемая одноцепочечная ДНК участвует в различных процессах, таких как репликация, рекомбинация, и репарация. ДНК геликазы необходимы для репликации, репарации, рекомбинации и транскрипции. Геликазы присутствуют во всех организмах.

ДНК-топоизомеразы

ДНК-топоизомеразы-ферменты, изменяющие степень сверхспиральности и тип сверхспирали. Путём одноцепочечного разрыва они создают шарнир, вокруг которого нереплецированный дуплекс ДНК, находящейся перед вилкой, может свободно вращаться. Это снимает механическое напряжение, возникающее при раскручивании двух цепей в репликативной вилке, что является необходимым условием для её непрерывного движения. Кроме того, топоизомеразы (типа II) обеспечивают разделение или образование катенанов - сцепленных кольцевых ДНК (образуются в результате репликации кольцевой ДНК), а также устранение узлов и спутанных клубков из длинной линейной ДНК. Существует два типа топоизомераз. Топоизомеразы типа I уменьшают число сверхвитков в ДНК на единицу за один акт. Эти топоизомеразы надрезают одну из двух цепей, в результате чего фланкирующие дуплексные области могут повернутся вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Эта реакция не требует энергии АТФ, т.к. энергия фосфодиэфирной связи сохраняется благодаря тому, что тирозиновый остаток в молекуле фермента выступает то в роли акцептора, то в роли донора фосфорильного конца разрезанной цепи.

Топоизомеразы типа II вносят временные разрывы в обе комплиментарные цепи, пропускают двухцепочечный сегмент той же самой или другой молекулы ДНК через разрыв, а затем соединяют разорванные концы. В результате за один акт снимаются два положительных или отрицательных сверхвитка. Топоизомеразы типа II тоже используют тирозиновые остатки для связывания 5¢-конца каждой разорванной цепи в то время. когда другой дуплекс проходит через место разрыва.

Праймаза

Праймаза-фермент, обладающий РНК-полимеразной активностью; служит для образования РНК-праймеров, необходимых для инициации синтеза ДНК в точке ori и дальнейшем для синтеза отстающей цепи.